Oligo Purification: Reverse Phase Cartridge

Gel Purification

Все олигонуклеотиды Gene Link длиной менее 40 мер не требуют дальнейшей очистки, если их применяют для ПЦР или секвенирования.

20-мерный олигонуклеотид, синтезированный с эффективностью связывания 99,5%, будет содержать ~90% полноразмерных 20-меров и смесь укороченных последовательностей ~10%.

По мере увеличения длины олигонуклеотида даже при эффективности связывания 99,5% выход полноразмерного олигонуклеотида снижается. Неочищенный 60-мерный продукт будет содержать ~75% полноразмерных олигонуклеотидов, и аналогичным образом 100-мерный продукт будет содержать ~60%.

Настоятельно рекомендуется очистка олигонуклеотидов длиной более 50 мер.

Очистка (цена за олигонуклеотид ДНК; USD)

Продукт	шкала 50 нмоль	шкала 200 нмоль	1 мкмоль шкалы	шкала 2 мкмоль	шкала 10 мкмоль	шкала 15 мкмоль
№ по каталогу (СТРАНИЦА)	26-6400-77	26-6400-77	26-6400-55	26-6400-88	26-6400-44	26-6400-99
Очистка геля (СТРАНИЦА)	$75. 00	$75.00	$150.00	280,00 долларов США	1500,00 долларов США	$1800.00
Каталожный № (РПЦ)	26-6400-11	26-6400-11	26-6400-22	26-6400-23	26-6400-33	26-6400-34
Очистка с обратной фазой (RPC)	$30.00	$30.00	$90.00	$170.00	750,00 долларов США	900,00 долларов США

Настоятельно рекомендуется очистка олигонуклеотидов длиной более 50 мер.

ВЭЖХ/РПХ

Методы очистки HPLC и RPC (картридж с обращенной фазой) обеспечивают чистоту от 85% до 95% в зависимости от последовательности, содержания GC и длины олигонуклеотида.
ВЭЖХ с обращенной фазой не работает выше 40 мер, поскольку более длинные олигонуклеотиды по своей природе гидрофобны и связываются неспецифически.

Очистка полиакриламидного геля (PAGE)

Очистка этим методом считается золотым стандартом очистки олигонуклеотидов и обеспечивает чистоту 99%+.
Гель-очистку можно использовать для олигонуклеотидов любой длины (по сравнению с картриджами для ВЭЖХ и RPC, которые ограничены олигонуклеотидами длиной менее 40 мер).
Очистка геля настоятельно рекомендуется для всех применений, связанных с клонированием продукта, таких как мутагенез и конструирование генов.

Сравнение неочищенного, RPC и
Гель очищенные олигонуклеотиды

Электрофорез неочищенных, обращенно-фазовых картриджей (RPC) и очищенных в геле олигонуклеотидов в полиакриламидном геле. Приблизительно 15 мкг сырого неочищенного олигонуклеотида загружали, чтобы показать усеченные последовательности отказа. Загружали приблизительно 8 мкг очищенного олигонуклеотида. Дорожки 1-3: 68 мер; дорожки с 4 по 6: 56 мер. Дорожки 1 и
4: сырой неочищенный; дорожки 2 и 5: очищенный RPC; дорожки 3 и 6: очищенный гель.
Результаты: Представленное выше изображение геля показывает недостаточную эффективность очистки RPC по сравнению с очисткой гелем. Обратите внимание на оставшиеся усеченные последовательности олигонуклеотидов, которые не удалось очистить с помощью метода RPC.

Сравнение неочищенного и
Гель очищенные олигонуклеотиды

Электрофорез в полиакриламидном геле сырых и
гель-очищенные олигонуклеотиды на соседних дорожках. Дорожки 1 и 2: 63 члена; дорожки 3 и 4: 96 мер; дорожки 5 и 6: 175 мер; переулки 7 и 8: 43 кв.
Результаты: В Gene Link мы рекомендуем гель
очистка всех длинных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, используемых в приложениях для клонирования. Очистка геля является золотым стандартом очистки, так как разрешение денатурирующего полиакриламидного геля приближается к одному основанию, а основная полоса четко видна для удаления и очистки.

Модификации после синтеза Конъюгация/конверсия (NHS, тиол, малеимид и т.

д.) Шкала синтеза и выхода

Большинство модификаций олигонуклеотидов напрямую связаны с использованием оптимизированных протоколов автоматического синтеза ДНК, которые подходят для конкретных модификаций.
Конечный выход варьируется и обычно составляет около 80% от выхода немодифицированных олигонуклеотидов.
Множественные модификации и сайты в одном и том же олигонуклеотиде могут привести к дальнейшему снижению конечного выхода.

Некоторые модификации (например, флуоресцентные красители Alexa, дигоксигенин и т. д.) недоступны для прямого автоматического связывания.
химии и должны быть конъюгированы с использованием методов постсинтеза, включающих

аминогруппа в сложный эфир NHS (N-гидроксисукцинимид),

тиолов в малеимид и другие превращения после синтеза.

Эта кинетика реакции конъюгации после синтеза дает ~ 60-85% конечного продукта, и рекомендуется очистка в полиакриламидном геле.
Рекомендации по выходу приведены ниже для этих конъюгаций после синтеза.

Настройка обратной транскрипции | Thermo Fisher Scientific

Для экспериментов по молекулярной биологии обратная транскрипция в первую очередь проводится для создания комплементарных ДНК (кДНК), представляющих ткане- или клеточно-специфические популяции РНК. Чтобы эксперименты были успешными, необходимо учитывать важные факторы, связанные с матрицей, реагентами и условиями реакции.

На этой странице:

• RNA template preparation
• Genomic DNA removal
• Reverse transcriptase considerations
• Primer selection
• Main reaction components

• Reaction temperature and time considerations
• First-strand and second-strand cDNA synthesis
• References
• Ресурсы

Видео: Упрощенная обратная транскрипция

Узнайте, как работает обратная транскрипция и как выбрать правильные обратные транскриптазы и праймеры для эксперимента.

Подготовка матрицы РНК

РНК служит матрицей в обратной транскрипции. Полная РНК обычно используется в синтезе кДНК для последующих приложений, таких как RT-(q)PCR, тогда как определенные типы РНК (например, матричная РНК (мРНК) и малые РНК, такие как микроРНК) могут быть обогащены для определенных приложений, таких как создание библиотеки кДНК. и профилирование микроРНК.

Поддержание целостности РНК имеет решающее значение и требует особых мер предосторожности во время выделения, обработки, хранения и экспериментального использования. Передовые методы предотвращения деградации РНК включают ношение перчаток, пипетирование наконечниками с аэрозольным барьером, использование лабораторного оборудования и реагентов, не содержащих нуклеазы, а также обеззараживание рабочих зон.

Для выделения и очистки РНК доступны различные стратегии в зависимости от типа исходных материалов (например, кровь, ткани, клетки, растения) и целей экспериментов. Основными целями рабочих процессов выделения являются стабилизация молекул РНК, ингибирование РНКаз и максимальное увеличение выхода с помощью надлежащих методов хранения и экстракции. Оптимальные методы очистки удаляют из растительных тканей эндогенные соединения, такие как сложные полисахариды и гуминовые кислоты, которые мешают активности ферментов, и обычные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как соли, ионы металлов, этанол и фенол. После очистки РНК следует хранить при температуре –80°C с минимальными циклами замораживания-оттаивания.

Видео: Ингибиторы обратной транскрипции

Узнайте об ингибиторах обратной транскриптазы, механизмах их ингибирования и советы по преодолению ингибиторов обратной транскрипции.

Существует несколько методов оценки качества и количества РНК после очистки. Распространенным подходом является УФ-спектроскопия для измерения поглощения на определенных длинах волн. Количество РНК можно определить по поглощению при 260 нм с использованием закона Бера-Ламберта, а о наличии или отсутствии определенных примесей можно судить по соотношению поглощений при разных длинах волн (9).0007 Таблица 1 ). Обратите внимание, что УФ-поглощение не специфично только для РНК, поскольку все нуклеиновые кислоты поглощают УФ-излучение с одинаковыми длинами волн. Для более специфичного и чувствительного анализа РНК можно рассмотреть флуоресцентный анализ с красителями, которые испускают сигнал только тогда, когда они специфически связаны с молекулами-мишенями.

Видео: Что такое коэффициент чистоты?

Узнайте об определении чистоты пробы по абсорбции и расчете соотношений A260/A280.

Таблица 1. Рекомендации по измерению УФ-излучения для анализа РНК

Absorbance	Indicates presence of:	Target ratios
230 nm	Organic compounds, sugars, urea, salts	A 260 /A 230 > 1.8
260 nm	All nucleic acids	A 260 ≈ 0.1–1.0
270 nm	Phenol	A 260 / A 270 > 1.0
280 nm	Protein	RNA: A 260 /A 280 ≈ 2. 0 DNA: A 260 /A 280 ≈ 1.8
330 nm	Light scattering	A 330 = 0

Целостность РНК можно оценить путем сравнения 28S и 18S рибосомных РНК (рРНК) как представления общей РНК. Тотальную РНК денатурируют, а затем разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза, который по своей природе является качественным. Затем оценивают соотношение интенсивностей 28S рРНК и 18S рРНК с соотношением 2:1, указывающим на интактную РНК (9).0007 Рисунок 1A ). Более количественный метод, разработанный Agilent Technologies, сочетает в себе микрофлюидику и запатентованный алгоритм для оценки целостности РНК. Этот метод дает цифровое считывание, называемое числом целостности РНК или RIN, где значения в диапазоне от 8 до 10 указывают на высокое качество РНК [1,2] (, рис. 1B, ).

Рис. 1. Анализ целостности РНК с помощью (A) гель-электрофореза и (B) микрофлюидики.

Удаление геномной ДНК

Иногда следовые количества геномной ДНК (гДНК) могут быть очищены совместно с РНК. Загрязнение гДНК может мешать обратной транскрипции и может привести к ложноположительным результатам, более высокому фону или более низкому уровню обнаружения в чувствительных приложениях, таких как RT-qPCR.

ДНКазу I обычно добавляют к выделенной РНК для удаления гДНК. ДНКазу I необходимо полностью удалить перед проведением ОТ-ПЦР, поскольку любой остаточный фермент будет разрушать одноцепочечную ДНК, например праймеры и синтезированную кДНК. Часто инактивация ДНКазы I (например, обработка ЭДТА и нагревание) или процедуры удаления фермента приводят к деградации РНК или потере образца.

В качестве альтернативы ДНКазе I доступны двухцепочечные ДНКазы для удаления загрязняющих гДНК без воздействия на РНК или одноцепочечные ДНК. Их термолабильность позволяет легко инактивировать их при относительно мягкой температуре (например, 55°C) без отрицательных воздействий. Такие двухцепочечные термолабильные ДНКазы можно инкубировать с РНК в течение 2 минут при 37°C перед реакцией обратной транскрипции, чтобы упростить рабочий процесс (, рис. 2, ).

Рис. 2. Процедуры удаления гДНК: ДНКаза I в сравнении с ферментом ezDNase от Invitrogen. По сравнению с ДНКазой I фермент ezDNase обеспечивает более короткий рабочий процесс, более простую процедуру и меньшее повреждение РНК. Инактивация фермента ezDNase перед обратной транскрипцией необязательна, поскольку фермент не расщепляет праймеры, одноцепочечную РНК или комплексы кДНК:РНК.

Обращение к транскриптазе

Класс ферментов, известных как обратные транскриптазы, синтезирует комплементарную ДНК с использованием РНК в качестве матрицы, но они могут различаться по функциональной активности и свойствам. Их свойства влияют на их способность к обратной транскрипции длинных транскриптов РНК, РНК, богатой GC, РНК со значительными вторичными структурами и РНК субоптимального качества. ( Белая книга: Сравнение эффективности обратных транскриптаз)

Большинство обратных транскриптаз, используемых в молекулярной биологии, происходят из гена pol вируса птичьего миелобластоза (AMV) или вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV). Обратная транскриптаза AMV была одним из первых ферментов, выделенных для синтеза кДНК в лаборатории. Фермент представляет собой гетеродимер с молекулярной массой 170 кДа с оптимальным интервалом температур реакции 42–48°С. Обратная транскриптаза AMV обладает сильной активностью РНКазы H, которая расщепляет РНК в гибридах РНК:кДНК, что приводит к более коротким фрагментам кДНК (<5 т.п.н.).

Обратная транскриптаза MMLV стала популярной альтернативой благодаря своей мономерной структуре, которая позволяла упростить клонирование и модификации рекомбинантного фермента. Обратная транскриптаза MMLV представляет собой фермент с молекулярной массой 75 кДа с оптимальной температурой реакции около 37°C. Хотя она менее термостабильна, чем обратная транскриптаза AMV, обратная транскриптаза MMLV способна синтезировать более длинные кДНК (<7 т. п.н.) с более высокой эффективностью из-за меньшей активности РНКазы Н [3].

Для дальнейшего улучшения синтеза кДНК была сконструирована обратная транскриптаза MMLV для еще более низкой активности РНКазы H (т. е. мутантный домен РНКазы H или RNaseH 9).0962 – ), повышенной термостабильностью (до 55°С) и повышенной технологичностью (в 65 раз выше). Эти атрибуты приводят к увеличению длины и выхода кДНК, более высокой чувствительности, улучшенной устойчивости к ингибиторам и более быстрому времени реакции (, таблица 2, ) [4]. ( Подробнее: атрибутов обратной транскриптазы)

Таблица 2. Общие обратные транскриптазы и их атрибуты.

3 12

3 10 мин

113

Target length

Выбор грунтовки

Чтобы инициировать обратную транскрипцию, обратным транскриптазам требуется короткий олигонуклеотид ДНК, называемый праймером, который связывается с комплементарными последовательностями на матрице РНК и служит отправной точкой для синтеза новой цепи. В зависимости от матрицы РНК и последующего применения доступны праймеры трех основных типов: олиго(dT) праймеры, случайные праймеры и ген-специфические праймеры (9).0007 Рисунок 3 ).

Рисунок 3. Общие праймеры, используемые в обратной транскрипции.

• Олиго(dT) праймеры состоят из фрагмента из 12–18 дезокситимидинов, которые отжигаются с поли(А)-хвостами эукариотических мРНК, которые составляют лишь 1–5% от общей РНК. Эти праймеры являются оптимальным выбором для конструирования библиотек кДНК из эукариотических мРНК, клонирования полноразмерной кДНК и быстрой 3′-амплификации концов кДНК (3′-RACE). Из-за своей специфичности в отношении поли(А)-хвостов олиго(dT)-праймеры не подходят для деградированных РНК, например, из образцов, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE), а также для РНК, у которых отсутствуют поли(А)-хвосты, такие как как прокариотические РНК и микроРНК. Поскольку синтез кДНК начинается с 3′-поли(А)-хвоста, олиго(dT)-праймеры потенциально могут вызывать смещение 3′-конца. РНК со значительной вторичной структурой может также нарушать синтез полноразмерной кДНК, что приводит к недостаточному представлению 5′-концов.

  Праймеры Oligo(dT) могут быть модифицированы для повышения эффективности обратной транскрипции. Например, длина олиго(dT) праймеров может быть увеличена до 20 нуклеотидов или более, чтобы сделать возможным их отжиг в реакциях обратной транскрипции при более высоких температурах. В некоторых случаях олиго(dT) праймеры могут включать вырожденные основания, такие как dN (dA, dT, dG или dC) и dV (либо dG, dA, либо dC) на 3′-конце. Эта модификация предотвращает проскальзывание поли(А) и блокирует сайт праймирования непосредственно перед хвостом поли(А). Эти праймеры называются заякоренный олиго(dT) .

• Случайные праймеры представляют собой олигонуклеотиды со случайными последовательностями оснований. Они часто имеют длину шесть нуклеотидов и обычно называются случайными гексамерами, N ₆ или dN ₆ . Из-за их случайного связывания (т.е. отсутствия специфичности к матрице) случайные праймеры потенциально могут отжигаться с любыми видами РНК в образце. Следовательно, эти праймеры можно рассматривать для обратной транскрипции РНК без поли(А)-хвостов (например, рРНК, тРНК, некодирующих РНК, малых РНК, прокариотических мРНК), деградированных РНК (например, из ткани FFPE) и РНК с известные вторичные структуры (например, вирусные геномы).

  Хотя случайные праймеры помогают улучшить синтез кДНК для обнаружения, они не подходят для полноразмерной обратной транскрипции длинной РНК. Увеличение концентрации случайных гексамеров в реакциях обратной транскрипции увеличивает выход кДНК, но приводит к получению более коротких фрагментов кДНК из-за повышенного связывания в нескольких сайтах на одной и той же матрице (, рис. 4, ).

  Более того, использование только случайных праймеров может быть не идеальным для некоторых применений ОТ-ПЦР. Например, переоценка числа копий мРНК является одной из проблем [5]. Смесь oligo(dT) и случайных праймеров часто используется в двухэтапной ОТ-ПЦР для достижения преимуществ каждого типа праймеров. Для анализа экспрессии микроРНК (миРНК) случайные гексамеры не подходят, и необходимо разработать специальные праймеры для обратной транскрипции микроРНК [6,7].

Рис. 4. Длина и выход кДНК зависят от выбора и концентрации праймера. РНК длиной 6,4 т.п.н. с поли(А)-хвостом была подвергнута обратной транскрипции в двухцепочечную (дц) кДНК с использованием олиго (дТ) праймера или случайных гексамеров в различных концентрациях. Результаты анализировали электрофорезом в агарозном геле. Увеличение концентрации случайных гексамеров приводило к более высокой концентрации коротких кДНК по сравнению с более дискретными, более длинными продуктами транскрипции с олиго(dT) праймерами.

• Ген-специфические праймеры обеспечивают наиболее специфический прайминг в обратной транскрипции. Эти праймеры разработаны на основе известных последовательностей РНК-мишени. Поскольку праймеры связываются со специфическими последовательностями РНК, для каждой РНК-мишени необходим новый набор ген-специфических праймеров. В результате для анализа нескольких РНК-мишеней требуется больше РНК. Генеспецифические праймеры обычно используются в приложениях одноэтапной ОТ-ПЦР. ( Информационный документ: Усовершенствованная система одноэтапной ОТ-ПЦР)

Таблица 3. Сравнение распространенных праймеров для обратной транскрипции.

Основные компоненты реакции

Помимо фермента и праймеров, основными компонентами реакции для обратной транскрипции являются матрица РНК (предварительно обработанная для удаления геномной ДНК), буфер, dNTP, DTT, ингибитор РНКазы и вода, не содержащая РНКазы ( Рисунок 5 ).

Рисунок 5. Реакция обратной транскрипции с ее основными компонентами.

• Матрицу РНК готовят, как описано в предыдущих разделах. В таблице 4 представлен рекомендуемый диапазон вводимой РНК для реакций обратной транскрипции, а оптимальное количество зависит от преобладания целевой последовательности и чувствительности обратной транскриптазы.

Таблица 4. Рекомендуемые диапазоны количества вводимой РНК в реакциях обратной транскрипции.

• Реакционный буфер поддерживает благоприятный рН и ионную силу для реакции. Поставляемый буфер может также содержать добавки для повышения эффективности обратной транскрипции.

• dNTPs обычно должны быть в концентрации 0,5–1 мМ каждый, предпочтительно в эквимолярной концентрации. Для обеспечения качественной обратной транскрипции рекомендуется использовать свежеразведенные высококачественные dNTP.

• DTT , восстанавливающий реагент, часто включается для оптимальной активности фермента. Эффективность реакции может быть снижена, если DTT или другие добавки выпадают в осадок; следовательно, компоненты реакции должны быть растворены и хорошо перемешаны.

• Ингибитор РНКазы обычно включают в реакционный буфер или добавляют в реакцию обратной транскрипции для предотвращения деградации РНК. РНКазы могли быть совместно очищены во время выделения или введены во время подготовки реакции. Существует ряд известных РНКаз, и соответствующие ингибиторы РНКазы следует выбирать на основе их механизма действия и требований к реакции.

• Вода, используемая в реакциях обратной транскрипции, не должна содержать нуклеазы. Рекомендуется вода из коммерческого источника, не содержащая нуклеаз, или вода, обработанная DEPC (диэтилпирокарбонатом) для удаления любых РНКаз. Загрязняющие РНКазы не могут быть удалены простой фильтрацией, а автоклавированная вода не подходит, поскольку РНКазы термостабильны.

Температура и время реакции

Реакции обратной транскрипции включают три основных этапа: отжиг праймеров, полимеризацию ДНК и дезактивацию фермента ( Рисунок 6 ). Температура и продолжительность этих стадий зависят от выбора праймера, РНК-мишени и используемой обратной транскриптазы.

Рис. 6. Три основных этапа синтеза кДНК.

• Отжиг праймеров: Праймер смешивают с матрицей РНК, нагревают до 65°C в течение 5 мин, затем инкубируют на льду не менее 1 мин. Это помогает гарантировать, что РНК является одноцепочечной и что праймер эффективно отжигает мишень. После отжига добавляют обратную транскриптазу и необходимые компоненты (например, буфер, дНТФ, ингибитор РНКазы).

• Полимеризация ДНК: На этом этапе температура и продолжительность реакции могут варьироваться в зависимости от выбора праймера и используемой обратной транскриптазы. С олиго(dT) праймером (Tm ~35–50°C) реакцию можно инкубировать непосредственно при оптимальной температуре обратной транскриптазы (37–50°C). Случайные гексамеры обычно имеют более низкую Tm (~ 10–15 ° C) из-за их меньшей длины. Поэтому, когда используются случайные гексамеры (отдельно или в сочетании с олиго(dT)), мы рекомендуем инкубировать реакцию обратной транскрипции при комнатной температуре (~ 25 ° C) в течение 10 минут после добавления фермента для продления праймеров.

  Среди обратных транскриптаз существуют различия в термостабильности, которая, в свою очередь, определяет самую высокую оптимальную температуру полимеризации для каждой из них. Использование термостабильной обратной транскриптазы позволяет при более высокой температуре реакции (например, 50°C) способствовать денатурации РНК с высоким содержанием GC или вторичных структур без влияния на активность фермента ( Рисунок 7 ). Инкубация при высокой температуре с такими ферментами может привести к увеличению выхода, длины и представительства кДНК. ( Белая бумага: Исследования производительности обратной транскриптазы SuperScript IV)

  Время полимеризации зависит от процессивности обратной транскриптазы, которая относится к количеству нуклеотидов, включенных в одно событие связывания. Например, обратной транскриптазе MMLV дикого типа с низкой процессивностью часто требуется >60 мин для синтеза кДНК. Напротив, сконструированной обратной транскриптазе с высокой процессивностью может потребоваться всего 10 минут для синтеза кДНК размером 9 т.п.н. ( Узнать больше о процессивность обратной транскриптазы).

Рис. 7. Влияние термостабильности и ее влияние на активность обратной транскриптазы. Образцы, содержащие РНК различной длины, подвергали обратной транскрипции с использованием олиго(dT) праймеров и меченых радиоактивным изотопом dNTP. Продукты реакции разделяли с помощью гель-электрофореза и визуализировали с помощью авторадиографии. Термостабильная обратная транскриптаза дает высокие выходы кДНК даже при температуре выше 50°C.

Обратная транскрипция за 10 минут

Узнайте, как добиться обратной транскрипции за 10 минут с помощью высокопроцессивной обратной транскриптазы.

• Деактивация фермента: Заключительный этап в реакциях обратной транскрипции заключается в деактивации обратной транскриптазы. Температура дезактивации может находиться в диапазоне 70-85°С, в зависимости от термостабильности фермента. Деактивация обычно проводится в течение 5–15 минут, при более высокой температуре требуется меньше времени.

Синтез кДНК первой и второй цепи

Синтез кДНК из матрицы РНК, как описано в предыдущем разделе, дает гибрид кДНК:РНК. Этот процесс упоминается как синтез первой цепи кДНК . Если присутствует активность РНКазы H (как в обратных транскриптазах AMV и MMLV дикого типа), РНК гибрида кДНК:РНК расщепляется во время синтеза первой цепи. кДНК первой цепи (с гибридизированной с ней РНК или без нее) можно использовать непосредственно в некоторых приложениях, таких как ОТ-ПЦР, где термостабильная ДНК-полимераза (например, 9ДНК-полимераза 0956 Taq ) реплицирует комплементарную цепь кДНК.

При конструировании и секвенировании библиотеки кДНК кДНК первой цепи используется в качестве матрицы для создания двухцепочечной кДНК, представляющей РНК-мишени. Этот процесс известен как синтез кДНК второй цепи . При синтезе кДНК второй цепи рекомендуются обратные транскриптазы с минимальной активностью РНКазы Н, чтобы максимизировать длину и выход кДНК.

Для синтеза двухцепочечной кДНК часто используют другую ДНК-полимеразу (например, ДНК-полимеразу Т7, ДНК-полимеразу I, ДНК-полимераза Taq ) для получения комплементарной цепи первой цепи кДНК. В синтез двухцепочечной кДНК могут быть включены дополнительные ферменты, такие как ферменты, перечисленные ниже для модифицированного метода Гублера и Хоффмана [8] (, рис. 8, ).

Рис. 8. Синтез двухцепочечной кДНК по методу Гублера-Хоффмана.

• E. coli РНКаза H разрывает нити РНК комплексов кДНК:РНК, обеспечивая 3′-ОН сайты праймирования для синтеза ДНК.

• E. coli ДНК-полимераза I удлиняет цепи РНК с разрывами за счет 5’3′-полимеразной активности и заменяет цепь РНК в направлении синтеза за счет 5’3′-экзонуклеазной активности в процессе, известном как ник перевод .

• E. coli ДНК-лигаза запечатывает разрывы между вновь синтезированными сегментами кДНК. (ДНК-лигазу Т4 не следует использовать в качестве замены, поскольку она может лигировать двухцепочечные фрагменты кДНК с тупыми концами и образовывать химерные структуры.)

• ДНК-полимераза T4 затупляет концы двухцепочечной кДНК (необязательно на последнем этапе).

В заключение, успех обратной транскрипции сильно зависит от компонентов и условий реакции. Реакции следует проводить надлежащим образом, чтобы они соответствовали интересующим последующим приложениям.

использованная литература

1. Шредер А., Мюллер О., Стокер С. и др. (2006) RIN: номер целостности РНК для присвоения значений целостности измерениям РНК. БМС Мол Биол 7:3.
2. Mueller O, Lightfoot S, Schroeder A (2016) Номер целостности РНК (RIN) – Стандартизация контроля качества РНК. Публикация Agilent Technologies 5989-1165EN.
3. Invitrogen Corp. (2002 г.) Высокопроизводительный RT для надежности в каждом эксперименте. (брошюра)
4. Thermo Fisher Scientific (2015) Обратная транскриптаза SuperScript IV. (Белая книга)
5. Zhang J, Byrne CD (1999) Дифференциальное праймирование матриц РНК во время синтеза кДНК заметно влияет как на точность, так и на воспроизводимость количественной конкурентной ПЦР с обратной транскриптазой. Biochem J 337 (Pt 2): 231–241.
6. Чен С., Ридзон Д.А., Брумер А.Дж. и др.